實(shí)驗原理

一般來(lái)說(shuō)OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白質(zhì)的吸光度。OD230代表其他雜質(zhì)（多糖等）的吸光度。一般認為，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之間認為RNA居多且較純。當比值低于1.8時(shí)，考慮有蛋白質(zhì)或酚污染；當比值高于2.0時(shí)，表明可能有異硫氰酸殘存。 

（實(shí)拍圖）

具體操作

1、UV-1600PC紫外分光光度計開(kāi)機預熱20min；

2.設定紫外波長(cháng) 260nm，用ddH2O洗滌比色皿，向比色皿中加入 50ul ddH2O，放入樣品室的S池架上，校零；

3.將待測樣品稀釋?zhuān)≧NA 5ul用ddH2O稀釋至50μl）混勻后，記錄編號和稀釋倍數；

4.把混勻的待測樣品移入干凈的比色皿中，放進(jìn)樣品室的S架上，記錄穩定的OD260(A260)的值；

5.以同樣的方式測待測樣品在280nm下的OD值；

6.計算待測樣品的濃度與純度:

RNA樣品的濃度（ng/μl）=OD260×稀釋倍數×40;

純度=OD260/OD280

舉例說(shuō)明

某客戶(hù)某一組樣品RNA測得OD260=1.016Abs，OD280=0.533Abs

根據計算公式可得：

       RNA濃度  1.016×40×10=406.4 ng/ul

       RNA純度  1.016/0.533=1.906

  此濃度和純度均適合做PCR。

問(wèn)題分析

 (1)蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

(2)苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。

(3)多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì )導致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類(lèi)材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。

(4)設備限制：測定OD260及OD280數值時(shí)，要使OD260讀數在0.1-0.5之間，此范圍線(xiàn)性最好。用水稀釋樣品：測OD值時(shí)，對照及樣品稀釋液請使用10 mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導致比值偏低。