RNA 是生物體重要的遺傳物質(zhì)，RNA 的提取是分子生物學(xué)的基礎實(shí)驗，對于 c DNA 文庫構建、熒光定量 PCR、RT-PCR、Northern 雜交等下游分子生物學(xué)實(shí)驗來(lái)說(shuō)，都需要質(zhì)量好的，完整性高的 RNA，今日中洪君匯總了常溫組織RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題，總有你需要！

實(shí)驗前的準備

       1、要了解你的實(shí)驗室環(huán)境，了解你的實(shí)驗環(huán)境中可能存在的隱患：是否有同事在進(jìn)行DNA抽提？是否實(shí)驗室人員眾多？

       2、要了解你可以使用的設備：離心機是否可以低溫操作？破碎、勻漿的條件怎樣？

       3、要了解抽提RNA的目的。

       4、要了解樣品的采集、制備、保存的條件，了解樣品的特點(diǎn)。

       有了充分的了解后，才能正確選擇合適的方法/試劑，提高抽提的成功率。  

RNA抽提“三大紀律八項注意”

       紀律一：杜絕外源酶的污染。    

       注意一：嚴格戴好口罩，手套。    

       注意二：認真處理實(shí)驗所涉及到的試劑、耗材、環(huán)境。

       紀律二：阻止內源酶的活性。

       注意三：選擇合適的勻漿方法。    

       注意四：選擇合適的裂解液。    

       注意五：控制好樣品的起始量。    

       注意六：勻漿操作快速而徹底。 

       紀律三：明確自己的抽提目的    

       注意七：任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下

降。    

       注意八：RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟的標準是后續實(shí)驗的一次成功，而不

是得率。

RNA抽提的10大竅門(mén)

       1：快速阻止Rnase活性–樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活Rnase。   

       2：選擇合適的抽提方法–高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。   

       3：預判質(zhì)量要求– Northern，cDNA文庫構建對完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)對完整性要求不是很高。RT-PCR對純度(酶抑制物殘留)要求很高。   

       4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。   

       5：檢查 RNA的完整性–電泳檢測，28S:18S =2:1是完整的標志，1:1對大部分實(shí)驗也是可以接受的。   

       6：去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。   

       7：降低外源酶的污染–不能從外面又導入酶。   

       8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。  

       9：徹底溶解RNA，必要時(shí)可以65C加熱5分鐘。   

       10：合適的保存方法–短時(shí)間可以–20C保存，長(cháng)期請保存于–80C。

提高RNA得率的方法

       1：使用更有效的破碎/勻漿方法。RNA如果不能被有效釋放出來(lái)，得率是會(huì )降低的。液氮搗碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、電動(dòng)勻漿器勻漿，雖然麻煩，但都是獲得高得率的有效手段。  

       2：抽提試劑的更換。假如得率低不是由勻漿方法不徹底引起，則可能是所使用的試劑的裂解能力差導致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后換廠(chǎng)家。另外，可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的試劑/方法；使用苯酚/氯仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的損失是比較大的。   

       3：延長(cháng)沉淀時(shí)間。如果核酸濃度低，采取低溫沉淀、并延長(cháng)沉淀時(shí)間，可以獲得非常好的效果。

不同抽提總RNA方法的比較