從 GenBank數據庫上搜索獲得 GeneA基因的mRNA序列。

       從 網(wǎng)站 www．invitrogen.com/mai獲取工具用來(lái)設計 miRNA。

       選擇 GeneA基 因 mRNA序列中21nt片段為合適miRNA靶序列。

       結合線(xiàn)性化pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體(Invitrogen公司)的特點(diǎn)，設計4個(gè)64nt的pre-miRNA寡核苷酸序列，該序列針對 GeneA基因不同區域，并且得到寡核苷酸序列互補的序列，經(jīng)NCBI Blast的相似性搜索，排除其非特異同源性部分。

       其結構為 5’-TGC TG overhang + G + antisense target sequence+ miRNA loop + Sense target sequence-3’。

       將4對合成好的oligo進(jìn)行退火。

       將退火的4條雙鏈oligo用T4DNA連接酶與酶切后的線(xiàn)性載體連接。

       取連接反應物轉化 DH5α菌株，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，PCR鑒定與培養。

       利用小量提取試劑盒小提質(zhì)粒，經(jīng) PCR擴增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，取陽(yáng)性克隆菌液送公司測序鑒定。