血清中 miRNA 抽提和實(shí)驗設計經(jīng)驗談
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發(fā)布時(shí)間：2017-11-15
血液中 miRNA 的組成
血液中的 miRNA 到底是從何而來(lái)? 要往哪里 去? 這些 miRNA 的生理功能是什么? 以上這三個(gè)問(wèn)題是很多研究人員關(guān)心的問(wèn)題，事實(shí)上這些問(wèn) 題目前并沒(méi)有很明確的答案，我們知道 miRNA 是 內生性的短片段 RNA，長(cháng)度約 17 到 23 核苷酸， miRNA 可以藉由和信息 RNA（mRNA）結合誘導 信息 RNA 的降解，進(jìn)而調控信息 RNA 和相對蛋 白的表現。根據一些論文的揭示 1 和實(shí)驗室實(shí)際的 操作經(jīng)驗顯示，正常人的血液中 miRNA 的含量是 極微量的，但是在病人和檢體制備不佳的血液樣 本中卻可抽取到較大量的 miRNA，根據這些觀(guān)察 現象的合理臆測，病人血清中 miRNA 的來(lái)源，很 有可能是因疾病造成的組織壞死或細胞凋亡破裂 而流泄出來(lái)的胞內 miRNA，經(jīng)由病人和正常人的 基因表現的芯片圖譜比較，結果也傾向有或無(wú)表 現的差異，而非特定 miRNA 表現量上升；換言之，我們觀(guān)察到相關(guān)的研究中，病人的 miRNA 的表 現數目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都 有表現的 miRNA，表現量的高、低反而是其次的 表征。因此數據分析的邏輯和方法也必須根據之 而調整，但這些呈現異位性表現（ectopic expression）的 miRNA 并不影響其成為診斷疾病 和預后評估的標志的可能性。已經(jīng)有一些研究指 出，這些不經(jīng)常表現在循環(huán)系統的 miRNA 可以成 為良好的疾病診斷標志，如 miR-141 可以作為前 列腺癌的指標，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞（myocardial infraction）相關(guān)，miR-122 和藥物 造成的肝臟損傷有關(guān)。
血清中 miRNA 抽提的挑戰
1 、檢體的備制
血清（serum）好還是血漿（plasma）好?臨床上會(huì )根據檢驗的標的來(lái)選擇血液檢體的保存及制備方式，血清和血漿都是來(lái)自血液檢體的成分，但是根據制備的方式導致本質(zhì)上含有成分 有所不同?；谥苽涞姆椒芍?，血清是血液經(jīng) 由凝血反應后，再經(jīng)由離心沈淀所得到的上清液。而血漿則是血液在不凝血的狀況下，經(jīng)由離心 去除血球后的液體。然而有文獻指出，針對同一 個(gè)人的血清和血漿樣本抽提出來(lái)的 miRNA 的總量作比較，很明顯的血清抽提的總量明顯比血漿抽 提的來(lái)得高，這意謂著(zhù)制備的方法也會(huì )影響 miRNA 的抽提，據推測這些 miRNA 可能是因為 凝血反應，血小板或紅血球破裂后釋出的物質(zhì)， 其中包含 miRNA，雖然大部分的實(shí)時(shí)定量聚合鏈 反應（q-PCR）驗證結果顯示，血漿和血液的 miRNA 的表現圖譜并無(wú)顯著(zhù)差異，然而這個(gè)已經(jīng) 存在的風(fēng)險，可能在研究設計也是需要被考慮， 因此就理論上來(lái)說(shuō)，是以血漿的檢體較適合作為 生物標記的找尋 。
2、檢體的備制或保存不良是否可用?
已知血清或血漿中的 miRNA 的來(lái)源可能來(lái)自胞 內和胞外，尤其是血球（紅血球或白血球等），因此 處理方式不當會(huì )造成檢體的污染，改變 miRNA 的 組成和表現量，造成研究結果的偏差，尤其紅血 球的溶血現象影響甚劇，不僅會(huì )造成紅血球 miRNA 污染而且紅血球中的大片段 mRNA 亦會(huì ) 造成定量的失準和因降解而形成實(shí)驗的偽陽(yáng)性產(chǎn)生（圖一）。因此備制檢體時(shí)也要避免造成血球破裂 的動(dòng)作，如用太細的針頭抽血、或檢體保存不當 造成溶血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血 或溶血現象可能也是必須列入評估的考慮因素。 此外抗凝血劑的使用必須避免使用含有肝素 heparin 的凝血管，已知 heparin 會(huì )抑制反轉錄（reverse transcription）和聚合酶（polymerase）的反應，如果檢體會(huì )進(jìn)行 q-PCR 的驗證一定要避 免。同樣的血液檢體也含有抑制反轉錄和聚合酶 的成分，如果萃取時(shí)沒(méi)有移除干凈則會(huì )造成后續 實(shí)驗的失敗產(chǎn)生。
圖 一 .為血清抽提 miRNA 后，經(jīng)由 Agilent Bioanalyzer2100 分析的 RNA 圖譜，結果顯示提 取成功，提出物中只有 miRNA 片段留存 。圖二同圖一的實(shí)驗操作步驟 ，結果顯示雖然提取是成功的 ， 但是提出物中出現大片斷的可疑 DNA 或 RNA 片段 ， 可能原始的檢體中有溶血的現象等干擾因素 。
miRNA 的定量
在抽提成功的情形下，血清和血漿中僅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提總量可能都在 ng 甚或 pg 等級，這樣的結果意謂著(zhù)，運用現行的分亮度 計來(lái)測 OD 是不可行的（以 NaroDrop 為例：待測 濃度需高達 10ng/uL 才可信），而 Agilent bioana- lyzer 2100 也僅能做到定性的檢測，沒(méi)法做精準的 定量。檢視現行被使用的定量方法大概有：（一）在 等體積的血清或血液樣本中加入外控核酸 （spike），經(jīng)由抽提步驟后可經(jīng)由偵測外加的 spike 來(lái)校 正抽提的總量及效率，作為校正檢體因抽提效率 或誤差造成的差異。然而這只適用在檢體備制完 美及控制抽取技術(shù)無(wú)誤，對于個(gè)體表現差異大和 檢體備制質(zhì)量不一的檢體，并沒(méi)有辦法達到管控 的效用；（二）經(jīng)過(guò)分亮度計測 OD 加以定量，但是 除非抽提出的量達到分亮度計的可信水平，否則 這些數值大概都是假訊號，并不足以采信；（三）使用內控基因的表現量來(lái)做為校正。但根據研究 指出其實(shí)血清或血漿中 miRNA 的表現數量是有很 大的個(gè)體差異的，以正常人當研究對象分析其表 現的 miRNA 數量，最低 123 個(gè)；最高有 296 個(gè) ，可以有高達兩倍的差距，再加上沒(méi)有適合的內 控基因 （internal control gene）可以做為控制組，公認常用的內控基因 U6 或 SNORD RNAs 等，在個(gè)體間的表現也是差異很大并不適用 1,2。因此 透過(guò) Agilent Bioanalyzer 2100 的結果進(jìn)行 miRNA 相對定量；或從等體積血清抽提出 miRNA 再等比例取出進(jìn)行實(shí)驗，似乎是較可信的做法， 但是還是要取決于實(shí)驗的設計來(lái)決定。
結語(yǔ)
當我們理解了實(shí)驗的設計和預期可能的結果， 避開(kāi)了可能的干擾因素，做完芯片實(shí)驗拿到結果 后，可能要先審視一下原始數據再決定要用那種 方法來(lái)分析數據，例如；假設控制組只有表現 200 個(gè) miRNA，但是病人組表現 400 個(gè)，那經(jīng)常 被使用的芯片校正方法如：median scaling 或 75th percentile，可能就不適用
（本文轉載丁香通）
