剛入師門(mén)的呆萌·王最近悲喜交加。師傅董太師看他骨骼清奇顏值高，便給了他「鎮組之寶」——一塊尚方寶肉，并拍拍他的肩膀，「小王，拿著(zhù)這個(gè)好好做，稍微做出點(diǎn)東西，你就能順利拿上學(xué)位，當上小 PI，迎娶白富美，走向人生巔峰！」小王興高采烈拿著(zhù)這沉甸甸的寶肉，但左右思量都覺(jué)無(wú)從下手呀！便去請教大濕兄傲嬌·李，「師兄，師傅給了我一塊寶肉，讓我做點(diǎn)東西，你說(shuō)我是油炸、清蒸還是紅燒好呀？我尋思，我可能還做不過(guò)門(mén)口的黑料大爺呢，咋辦？」傲嬌·李聽(tīng)了，噗呲笑了， 「你個(gè)吃貨～董太師的意思，是讓你做組化 IHC ??！」「IHC，啥來(lái)頭？」李濕兄扶了扶眼鏡， 「IHC 可不是啥新鮮事兒，早在上個(gè)世紀七十年代，便已有人使用這項技術(shù)。近年來(lái)，隨著(zhù)『無(wú)圖無(wú)真相，王道即真理』觀(guān)念的強化，越來(lái)越多的研究使用這項古老且神秘的技術(shù)檢測組織標本中特定蛋白的表達和分布，使科學(xué)假想與體內環(huán)境有機結合，讓科學(xué)論文的質(zhì)量得以升華?！?/span>

       以下是燒腦寶典，欲練此功，無(wú)需自宮

       IHC 簡(jiǎn)而言之，統共分成七步：脫蠟／復水，抗原修復，淬滅（去除內源性過(guò)氧化物酶），封閉，抗體孵育及 DAB 顯色。前三步形似泡澡堂，后三步形似 Western blot。

       泡澡之前，我們得脫衣服，脫蠟就是給石蠟切片「脫衣服」的過(guò)程，即，用二甲苯將石蠟從切片上「脫」下來(lái)，總共脫 3 次，每次 5 min。在進(jìn)澡堂子之前，我們得穿上澡堂提供的浴袍，讓自己融入澡堂的環(huán)境。復水的目的就是利用乙醇的雙溶性，使得切片跟后續的水溶性實(shí)驗體系相容。這一步中，我們使用 100% 乙醇和 95% 乙醇各洗切片 2 次，每次 10 min。

       接下來(lái)，我們就能進(jìn)入 IHC 中極為重要的一步——泡澡，哦不，是抗原修復了?？乖迯偷哪康氖菍⒖乖砦坏靡员┞?，使得后續的一抗可以結合上去。目前而言，抗原修復的方式主要分為熱修復和酶修復兩種，其中熱修復是在微波爐或者高壓鍋中，切片在沸騰溫度（95～99℃）加熱一段時(shí)間后完成，所用到的修復液主要有檸檬酸緩沖液（pH＝6.0），EDTA（pH＝8.0）和 TE（pH＝9.0）三種；酶修復則是在 37℃ 溫箱中進(jìn)行，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶 K 進(jìn)行的酶解作用達到抗原修復的目的，使用這種修復方式需注意對修復液進(jìn)行預熱，使其在切片放入前，就已達到酶類(lèi)的最佳反應溫度。

       抗原修復是 IHC 中最重要的一環(huán)，目的蛋白抗原表位的修復效果影響著(zhù)后續的一抗結合效果，即影響著(zhù)最終的結果。在實(shí)驗開(kāi)始前，仔細閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，查看其推薦的修復條件。跟泡澡體驗相似的是，人太多體驗感就差，同理，在修復時(shí)不要貪多貪快，微波爐中一次只修復一缸，并根據容器體積，加入其推薦的修復液的量（CST 的推薦用量為 250 ml）。

       此外為了保證實(shí)驗具有良好的重復性，我們推薦使用濃縮修復液，這不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗準備工作，而且使實(shí)驗批次間所使用的修復液組分達到更佳的穩定性。

       在上述大事完成后，我們進(jìn)行的是 IHC 特色項目——淬滅（即去除內源性過(guò)氧化物酶）。目前絕大多數 IHC 都是基于 HRP 檢測系統，所以我們需要去除組織中內源性過(guò)氧化物酶的活性。只需在 3% H₂O₂ 中浸泡 10 min 即可。

此時(shí)的切片，便形似一張濕轉后的 western blot 膜——方方的載體上分布著(zhù)我們的蛋白。

       為了減少二抗與組織的非特異結合，我們需使用二抗來(lái)源的血清進(jìn)行封閉。由于 CST 的絕大多數一抗為鼠抗（mouse）和兔抗（rabbit），對應的二抗來(lái)源于羊（goat），所以我們使用 5% 正常羊血清（溶劑為 TBST），將其滴加到組織上，室溫封閉 1 h 即可。

       我們也可以使用 CST 新推出的不含動(dòng)物組分的封閉液 (Animal-FreeBlocking Solution (5X) #15019)，以達到更佳、更具實(shí)驗穩定性的封閉效果。

       擦去封閉液后（后方的同志注意了，不是洗去！不是洗去！不是洗去?。?，如同 western blot 一樣，我們可以進(jìn)行一抗孵育。一抗的特異性對染色結果有著(zhù)至關(guān)重要的作用。正所謂抗體選不好，Figure 有煩惱；抗體一跑偏，結果就坑爹。為了提高實(shí)驗的成功率及可信度，一定要選擇經(jīng)過(guò)周（dì）密（yù）嚴（mó）格（shì）驗證的高（C）大（S）上（T）抗體，并根據說(shuō)明書(shū)的提示，使用特定的稀釋體系配置抗體工作液。

       敷有一抗的切片在 4℃ 過(guò)夜并經(jīng)洗滌后，進(jìn)行二抗孵育。二抗的效力及其與一抗的契合度也影響著(zhù)染色結果。CST 開(kāi)發(fā)出了具有高靈敏度的二抗，可以與一抗成為融洽的 soulmate。

       二抗孵育并洗滌后，將新鮮配置的 DAB 顯色液滴加至切片上，進(jìn)行顯色反應，即棕黃色顆粒的形成。在顯色過(guò)程中，需對切片嚴密監控以控制合適的顯色程度（一般 1～10 min），當獲得合適的染色強度后，將切片浸泡于 dH₂O 中，終止顯色。

       Competitor antibodies used in accordance withmanufacturer recommendationsSignalStain?DAB Substrate Kit #8059:

       IHC analysis of paraffin-embedded human breastcarcinoma using Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP? Rabbit mAb #9145. Chromogenicdetection was performed using #8059 (left) or DAB supplied by a competitor(right).

       顯色結束后，可以根據實(shí)驗需要進(jìn)行核復染。核復染可以凸顯細胞結構，并有利于結果的觀(guān)察和判讀。目前，多數研究者使用的核復染試劑為蘇木精 (Hematoxylin #14166)，將細胞核染成藍色。

       最后，對切片進(jìn)行脫水、封片（DAB 顯色系統，可使用中性樹(shù)膠）。就能在顯微鏡下細細端詳品讀實(shí)驗結果啦。

       「原來(lái)如此，我趕緊買(mǎi)上 CST 的抗體試劑，向我的小康生活邁進(jìn)去！」小王迎夕陽(yáng)歡樂(lè )地扭動(dòng)著(zhù)小背影離開(kāi)了。

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