免疫熒光
從切片完成之后開(kāi)始
免疫實(shí)驗熒光器材
避光場(chǎng)所，濕盒，烘箱等加溫設備，吸水的紙，移液槍?zhuān)?.5ml EP管，微波爐，抗原修復用的容器，ph試紙或ph儀，蓋玻片，多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片等
免疫熒光實(shí)驗試劑
一抗
熒光二抗
Hoechst 33342（與雙鏈DNA結合，顯核，藍熒光）
抗體稀釋液（含1%BSA的PBS）
10×PBS（NaCl 42.5g，NaH?2PO4·2H2O1.482g， Na2H?PO4·12H2O 14.5055g，定容至500ml，配完最好高壓滅菌一下）。
PBS（10×PBS稀釋10倍，再調ph至7.2-7.4。用得可快了）。
10×檸檬酸鹽抗原修復液（C6H8O7·H2O
2g， Na3C6H5O7·2H2O
11.8g，定容至500ml，配完最好高壓滅菌一下）。
檸檬酸鹽抗原修復液（10×檸檬酸鹽抗原修復液稀釋10倍，再調ph至6.0）。
封片劑（0.672g
NaH?CO3
加40ml蒸餾水（其為0.2mol/L），以1mol/L的NaOH調其ph至9.0左右（ NaOH 加0.75ml左右吧）。吸取1ml此液體，與1ml 100%甘油混勻即可）
蒸餾水
免疫熒光程序：
包埋好的標本用切片機切石蠟切片（2微米），并將蠟片貼附于多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上（可購買(mǎi)，我用的是北京中衫的，從不掉片）。
經(jīng)60℃烘片2-8小時(shí)（都試過(guò)，沒(méi)啥差別，但非實(shí)質(zhì)性器官應適當延長(cháng)時(shí)間）。
二甲苯Ⅰ脫蠟4分鐘（若要保證脫蠟完全可將其加熱至40-60℃），二甲苯Ⅱ脫蠟6分鐘。
梯度酒精復水：100%酒精1分鐘，95%酒精1分鐘，75%酒精1分鐘（這個(gè)梯度是沒(méi)問(wèn)題的，而且都是現成的醫用酒精，不用配制），蒸餾水2分鐘，PBS 2分鐘×2次。
進(jìn)行抗原修復：將切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸櫞酸液修復液中，用微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰，再用中低火力維持10分鐘，停止加熱后自然冷卻20-30分鐘（我想還是煮沸6分鐘×4次更好）。
PBS浸洗2分鐘后滴加0.3%tritonX-100透膜劑透膜12分鐘（不透膜也沒(méi)關(guān)系，反正細胞早就被切開(kāi)了）。但注意細胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100，否則會(huì )被洗掉。
用PBS 2分鐘×2次洗去透膜液，用濾紙擦去標本外的PBS，滴加封閉血清（無(wú)色的10%FBS或免疫組化試劑盒北京中衫中的封閉液）在濕盒中37℃封閉30分鐘（室溫30分鐘也可）。
用濾紙擦去封閉液，勿洗。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過(guò)夜（37℃1小時(shí)多也差不多），再用PBS 3分鐘×5次洗去一抗，用濾紙擦去標本外的PBS。
滴加熒光二抗室溫置濕盒中避光孵育1-1.5小時(shí)，此時(shí)可在熒光顯微鏡下迅速觀(guān)察是否著(zhù)染，以確定終止時(shí)間。用PBS 3分鐘×3次洗去二抗，用濾紙擦去標本外的PBS。
滴加 Hoechst33342 避光孵育2分鐘，可對標本進(jìn)行顯核，藍色熒光，效果極佳。用PBS 1分鐘×3次洗去Hoechst 33342，用濾紙擦去標本外的PBS
最后用含抗熒光淬滅劑的封片液碧云天封片（可自配），并在熒光顯微鏡下立即觀(guān)察。
照相后可用photoshop將同一視野下不同的熒光圖像疊加，效果不錯，有一篇參考文獻支持。
▲注：若一張切片同時(shí)做兩種抗體的免疫熒光，則加一抗時(shí)可將兩種一抗按各自所需的濃度混合，但要注意抗體要來(lái)源于不同的動(dòng)物。加二抗時(shí)也可將兩種二抗按各自所需的濃度混合，但要注意二抗要有不同的顏色。
