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PCNA步驟

發(fā)布人：admin 瀏覽次數：1589 發(fā)布時(shí)間：2016-12-12

      PCNA步驟跟一般的免疫組化步驟基本一樣：

      1、脫蠟、水化

      1)  60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
      2)  100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
      3)  95% ethanol 2 minutes；
      4)  80% ethanol 2 minutes；
      5)  70% ethanol 2 minutes；
      6)  PBS洗3次×3 min
      7）封閉內源性過(guò)氧化物酶： 3%的過(guò)氧化氫，室溫封閉10min
      9)  PBS溶液洗3次×3 min。

      3、抗原修復暴露抗原決定族

     10)  切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次，每次間隔補足液體，防止干片。

      4、封閉非特異性蛋白

      11)  PBS溶液洗3次×3 min；
      12)  將切片取出,周?chē)钟脼V紙吸干,用組化筆在組織周?chē)?huà)上圈,在圓圈內組織滴入5%羊血清（與二抗來(lái)源一致）后放入濕盒中,室溫30（10～30）min；

 

       5、一抗孵育

      13)  甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周?chē)鷼埩粞?，直接加入已稀釋的一抗后，放入濕盒中室?小時(shí)，然后4度過(guò)夜，從冰箱中取出需37 ℃復溫45 min。

      6、二抗孵育

     14)  將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
     15)  用濾紙將圓圈周?chē)乃?，加入已稀釋的二抗后放?7 ℃恒溫烤箱中30 min（回收）。
     16)  用PBS洗5次×5 min；

      7、SP反應

     17)  加入SP后放入37度烤箱中30 min。
     18)  用PBS洗5次×5 min；

      8、顯色

     19)  加入DAB（快速滴入，觀(guān)察染色情況，倒掉染液），顯色時(shí)間控制在約5 min（3～10 min），由鏡下觀(guān)察顏色控制時(shí)間。

      9、復染、脫水、透明、封片

      20)  用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；
      21)  加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來(lái)水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍5 min。
      22)  脫水：
      70% ethanol 1-2 min
      95% ethanol 1-2 min；
      95% ethanol 1-2 min；
      100% absolute ethanol: (1-2) min；
      100% absolute ethanol: (1-2) min。
      23)  透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min

      24)  封片：中性樹(shù)膠。


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