免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來(lái)顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，熒光顯微鏡下即可觀(guān)察到熒光，下文主要列舉了三種細胞免疫熒光染色的實(shí)驗步驟。
 
一、zo-1的免疫熒光，步驟如下：
 
      1.  細胞在蓋片上生長(cháng)融合到95%-100%時(shí)，從孵箱中取出。

      2.  用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。

      3.  4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。

      4.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

      5.  0.2%Triton X-100透化2-5分鐘。

      6.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

      7.  5%BSA室溫封閉30分鐘。

      8.  加一抗（用1%BSA稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮?度過(guò)夜。
   
      9.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

      10.  加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。

      11.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

      12.  95%甘油封片。

      注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。

二、細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：

 

      1.  取出細胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細胞培養皿里，PBS洗三遍。

      注意：有的時(shí)候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。

      2.  4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

      3.  0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。

      4.  與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

      5.  一抗4度濕盒內過(guò)夜，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。

      6.  二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。

      7.  最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。

      8.  蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹(shù)脂那樣會(huì )干，所以不用指甲油封的話(huà)會(huì )弄的一塌糊涂。

建議：
      1.  還是染完之后沒(méi)有封片前直接照一些，因為有的時(shí)候可能封片會(huì )出現問(wèn)題，再想照反而沒(méi)有了，另外不要拖太長(cháng)時(shí)間，熒光會(huì )崔滅的。

      2.  熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話(huà)，過(guò)一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。

      3.  二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。

三、細胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗步驟如下：

 

      1.  漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí)。

      2.  -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。

      3.  PBS洗凈：3min×3。

      4.  1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。

      5.  PBS洗凈：2×5 min。

      6.  羊血清封閉：37度，20分鐘。

      7.  一抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí)。

      8.  4度PBS洗凈，3 min×5次。

      9.  二抗37度小于一小時(shí)。

      10.  37度 PBS洗凈，3×5 min。

      11.  涼干封片（封閉液PH8.5）
 

      不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(cháng)PBS清洗時(shí)間，如果結果背景較高可以延長(cháng)漂洗的次數和時(shí)間。

      （本文轉載丁香通）