養BMDC有好幾個(gè)月了，看了2、3篇文獻就開(kāi)搞，發(fā)現論壇里還是有一些戰友養這個(gè)。就想開(kāi)個(gè)專(zhuān)題討論貼，請新手老手都上來(lái)談?wù)劷?jīng)驗或者問(wèn)些問(wèn)題。集思廣益，大家相互促進(jìn)下。
1. 取小鼠股骨脛骨，小鼠要年輕?。?W-8W，以前用只一年左右的養出來(lái)外形也張牙舞爪，但流式檢測沒(méi)有CD11c表達，很奇怪??；性別方面公母不限，經(jīng)典版本說(shuō)公的好，公的壯實(shí)，骨頭大）。
2. 沖骨髓細胞，我沖出來(lái)的骨髓細胞永遠沒(méi)有文獻上說(shuō)的那樣多，但不影響大局，我一次用兩只，怕出意外少了細胞，論壇里有戰友說(shuō)不要混一起，我不知道具體原因，盼賜教。
3. 細胞計數，不去紅細胞?。ú恢呛檬菈?，文獻說(shuō)去紅細胞會(huì )把一些祖細胞也去掉了）記數，計數只記白細胞（形態(tài)學(xué)區分，紅細胞無(wú)核較小，目前我的眼睛目前還在為此積累經(jīng)驗），2×10e6（似乎太低，這套方案作者是一皿養到第12天的，所以我個(gè)人覺(jué)得看你在哪天收細胞做下游實(shí)驗，如果只養到第6天或者第8天，多點(diǎn)應該也行吧？）白細胞種100 mm細菌培養皿（注意是細菌培養皿，說(shuō)懸浮細胞還是用細菌皿好，還說(shuō)抑制細胞貼壁，讓更多祖細胞向樹(shù)突細胞分化而不是巨噬細胞），這一天記為第0天。
4. 第3天加等體積（10 ml）BMDC培養基
配方：每50 ml含：1640基礎培養基45 ml，5 ml滅活胎牛血清，50 ul 100×的β-巰基乙醇（一直不知道它的作用，請高手跳出來(lái)作答謝謝?。?，500 ul 100×的谷氨酸鹽（谷氨酰胺？我現在用Gibco的Glutamax，說(shuō)不會(huì )降解產(chǎn)生氨），1 ug rmGM-CSF（Chemicon和PPT的都用過(guò)，現在用PPT，好像還行）。
5. 第6天，第8天半量換液，離心設置為300 g，5min（不知道夠不夠，肯定有損失）。
6. 第10天300 g，5min收集懸浮細胞轉到細胞培養皿（巨噬細胞多貼點(diǎn)壁），同時(shí)培養基成分里rmGM-CSF含量至少減半（好像說(shuō)怕繼續分化成非樹(shù)突吧，文獻看了有一段時(shí)間記得不那么清楚了慚愧啊，其實(shí)文獻僅供參考，也不一定對，關(guān)鍵還是自己的實(shí)踐）。
7. 第11天加LPS刺激其成熟，普遍認為（也可能是我自己認為），第6天或第8天收不成熟DC會(huì )比較多，看實(shí)驗需要，建議想要不成熟DC的朋友請在這兩天收網(wǎng)）。
我一般做到第5步就上流式，也就是6到8天的BMDC, CD11c表達波動(dòng)在50－80％，偶爾做CD86，成熟標志吧？15％左右。具體流式結果和光鏡形態(tài)照片過(guò)幾天（或幾周）發(fā)上來(lái)大家一起探討。MHC2我沒(méi)有做（技術(shù)員說(shuō)實(shí)驗室流式機器做APC的有關(guān)部件有故障，我的MHC2抗體正好帶APC）。還發(fā)現用PE標記和FITC標記的CD11c流式抗體檢測CD11c表達發(fā)現陽(yáng)性細胞數（還是表達量）相差1倍？（同一批細胞分兩管，分開(kāi)操作，抗體劑量不同，都過(guò)量了，都洗了兩遍，一個(gè)公司的抗體，25％和50％）。
最近有個(gè)造血生理的老師說(shuō)這個(gè)方案她們是用來(lái)養單核細胞和粒細胞（我已經(jīng)不確定了，得再問(wèn)問(wèn)她）的，對我打擊很大。說(shuō)聚集體包括粒細胞、巨噬細胞（還有什么不記得了，得再問(wèn)問(wèn)她）。她建議我流式檢測加個(gè)陰性指標，我覺(jué)得很有道理。我是不是檢測的指標太少了？發(fā)現國外的也有少有多，但沒(méi)有我這么少的。
我養出來(lái)的BMDC目前還從未做過(guò)功能實(shí)驗（MLR和CTL）。會(huì )陸續搞起，到時(shí)候上來(lái)求助大家。
總結：講得比較亂請戰友們諒解，我從未在論壇發(fā)過(guò)如此長(cháng)篇大論。請支持我，尤其是搞這個(gè)的，請頂一頂。拋磚引玉。希望本貼能成為BMDC培養的旗艦貼，不為別的，為搞這一塊或者用到這一實(shí)驗技術(shù)的菜鳥(niǎo)們（rookie）早日找到組織，為二年級生（sophomore，像我這種）繼續提高，恭候有豐富經(jīng)驗的大牛們（superstar）的大駕，為這一技術(shù)傳道授業(yè)解惑。謝謝??！
站友cj_1968認為：
1. 培養100％純的DC幾乎是不可能，一般達到85％就不錯了，在收集細胞是只要吹打不要太猛，巨噬細胞一般是不會(huì )懸浮起來(lái)的。
2. 我有時(shí)也幾只小鼠的骨髓細胞混養，但只要是同系（如：都是C57）的，問(wèn)題不大。
3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓細胞混養就不可避免地產(chǎn)生混合淋巴細胞培養。
站友dongwp認為：
骨髓細胞中有淋巴細胞，兩個(gè)個(gè)體的細胞混合會(huì )產(chǎn)生“混合淋巴細胞培養”反應，導致淋巴細胞大量增殖
（本文轉載：丁香通）
