目的  篩選并驗證 RAW264. 7 細胞中電穿孔轉染 TRIB3 過(guò)表達質(zhì)粒和 TRIB3 siRNA 的條件,建立適用于 RAW264. 7 細胞的最佳電穿孔轉染方案。

　　方法  通過(guò)改變脈沖電壓、脈沖時(shí)長(cháng)和質(zhì)粒濃度等條件,將載體 為 pCMV6-Entry 的 TRIB3 過(guò)表達質(zhì)粒和 TRIB3 siRNA 轉入 RAW264. 7 細胞,24 h 后相差顯微鏡觀(guān)察細胞形態(tài), CCK-8法檢測細胞存活率,72 h 后 Western Blot 法檢測 TRIB3 蛋白表達以驗證目的基因表達改變情況。

　　結果  (1) 以不同脈沖電壓轉染時(shí),110 和 120 mV 組細胞形態(tài)和存活率與對照組無(wú)差異,130 和 140 mV 組懸浮細胞較多、細胞存活率顯著(zhù)低于對照組(P< 0. 01),120、130 和 140 mV 組 TRIB3 蛋白表達顯著(zhù)增加(P< 0. 05);(2)以不同脈沖 時(shí)長(cháng)進(jìn)行轉染時(shí),10 和 20 ms 組細胞形態(tài)和存活率與對照組無(wú)差異,30 ms 組細胞存活率顯著(zhù)低于對照組(P< 0. 01),20 和 30 ms 組 TRIB3 蛋白表達顯著(zhù)增加(P< 0. 01);(3)以不同質(zhì)粒濃度進(jìn)行轉染時(shí),2 和 4 μg 組細胞形態(tài) 和存活率與對照組無(wú)差異,6 μg 組細胞存活率低于對照組(P< 0. 05),4 μg 組 TRIB3 表達顯著(zhù)增加(P< 0. 01);(4) 以 120 mV、20 ms 條件轉染不同濃度 TRIB3 siRNA 時(shí),各組細胞形態(tài)和存活率均與對照組無(wú)差異,10 nmol / L 組 TRIB3 表達僅為對照組的 0. 19 倍( P< 0. 01)。

　　結論 以 120 mV、20 ms 條件在 RAW264. 7 細胞中電穿孔轉染 TRIB3 過(guò)表達質(zhì)粒(每樣本 4 μg)和 TRIB3 siRNA(10 nmol / L),在保證較高的細胞存活率的同時(shí)能顯著(zhù)改變目的基 因的蛋白表達水平,為后續 RAW264. 7 細胞中質(zhì)粒轉染相關(guān)的基礎研究提供實(shí)驗依據和借鑒。